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		<title>3uzj - Revision history</title>
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			<title>OCA at 14:12, 14 March 2024</title>
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&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;Computational design is a test of our understanding of enzyme catalysis and a means of engineering novel, tailor-made enzymes. While the de novo computational design of catalytically efficient enzymes remains a challenge, designed enzymes may comprise unique starting points for further optimization by directed evolution. Directed evolution of two computationally designed Kemp eliminases, KE07 and KE70, led to low to moderately efficient enzymes (k(cat)/K(m) values of &amp;amp;lt;/= 5 10(4) M(-1)s(-1)). Here we describe the optimization of a third design, KE59. Although KE59 was the most catalytically efficient Kemp eliminase from this design series (by k(cat)/K(m), and by catalyzing the elimination of nonactivated benzisoxazoles), its impaired stability prevented its evolutionary optimization. To boost KE59's evolvability, stabilizing consensus mutations were included in the libraries throughout the directed evolution process. The libraries were also screened with less activated substrates. Sixteen rounds of mutation and selection led to &amp;amp;gt; 2,000-fold increase in catalytic efficiency, mainly via higher k(cat) values. The best KE59 variants exhibited k(cat)/K(m) values up to 0.6 10(6) M(-1)s(-1), and k(cat)/k(uncat) values of &amp;amp;lt;/= 10(7) almost regardless of substrate reactivity. Biochemical, structural, and molecular dynamics (MD) simulation studies provided insights regarding the optimization of KE59. Overall, the directed evolution of three different designed Kemp eliminases, KE07, KE70, and KE59, demonstrates that computational designs are highly evolvable and can be optimized to high catalytic efficiencies.&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
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&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;Bridging the gaps in design methodologies by evolutionary optimization of the stability and proficiency of designed Kemp eliminase KE59.,Khersonsky O, Kiss G, Rothlisberger D, Dym O, Albeck S, Houk KN, Baker D, Tawfik DS Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jun 8. PMID:22685214&amp;lt;ref&amp;gt;PMID:22685214&amp;lt;/ref&amp;gt;&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
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&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;==See Also==&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;==See Also==&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
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			<pubDate>Thu, 14 Mar 2024 14:12:09 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 08:18, 20 July 2022</title>
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			<pubDate>Wed, 20 Jul 2022 08:18:15 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 21:50, 5 August 2016</title>
			<link>http://52.214.119.220/wiki/index.php?title=3uzj&amp;diff=2653644&amp;oldid=prev</link>
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			<pubDate>Fri, 05 Aug 2016 21:50:32 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 07:17, 21 December 2014</title>
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&lt;tr&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;+&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #cfc; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;&lt;ins style=&quot;color: red; font-weight: bold; text-decoration: none;&quot;&gt;Computational design is a test of our understanding of enzyme catalysis and a means of engineering novel, tailor-made enzymes. While the de novo computational design of catalytically efficient enzymes remains a challenge, designed enzymes may comprise unique starting points for further optimization by directed evolution. Directed evolution of two computationally designed Kemp eliminases, KE07 and KE70, led to low to moderately efficient enzymes (k(cat)/K(m) values of &amp;amp;lt;/= 5 10(4) M(-1)s(-1)). Here we describe the optimization of a third design, KE59. Although KE59 was the most catalytically efficient Kemp eliminase from this design series (by k(cat)/K(m), and by catalyzing the elimination of nonactivated benzisoxazoles), its impaired stability prevented its evolutionary optimization. To boost KE59's evolvability, stabilizing consensus mutations were included in the libraries throughout the directed evolution process. The libraries were also screened with less activated substrates. Sixteen rounds of mutation and selection led to &amp;amp;gt; 2,000-fold increase in catalytic efficiency, mainly via higher k(cat) values. The best KE59 variants exhibited k(cat)/K(m) values up to 0.6 10(6) M(-1)s(-1), and k(cat)/k(uncat) values of &amp;amp;lt;/= 10(7) almost regardless of substrate reactivity. Biochemical, structural, and molecular dynamics (MD) simulation studies provided insights regarding the optimization of KE59. Overall, the directed evolution of three different designed Kemp eliminases, KE07, KE70, and KE59, demonstrates that computational designs are highly evolvable and can be optimized to high catalytic efficiencies.&lt;/ins&gt;&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
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			<pubDate>Sun, 21 Dec 2014 07:17:32 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 10:52, 20 March 2013</title>
			<link>http://52.214.119.220/wiki/index.php?title=3uzj&amp;diff=1745106&amp;oldid=prev</link>
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			<pubDate>Wed, 20 Mar 2013 10:52:26 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 10:33, 11 March 2013</title>
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			<pubDate>Mon, 11 Mar 2013 10:33:23 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 04:53, 27 June 2012</title>
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&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;The line below this paragraph, containing &amp;quot;STRUCTURE_3uzj&amp;quot;, creates the &amp;quot;Structure Box&amp;quot; on the page.&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;You may change the PDB parameter (which sets the PDB file loaded into the applet) &lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;or the SCENE parameter (which sets the initial scene displayed when the page is loaded),&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;or leave the SCENE parameter empty for the default display.&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt;-&lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #ffa; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;--&amp;gt;&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&amp;nbsp;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;{{STRUCTURE_3uzj|  PDB=3uzj  |  SCENE=  }} &lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;{{STRUCTURE_3uzj|  PDB=3uzj  |  SCENE=  }} &lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;/td&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;===Designed protein KE59 R13 3/11H with benzotriazole===&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;div&gt;===Designed protein KE59 R13 3/11H with benzotriazole===&lt;/div&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
&lt;tr&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;/td&gt;&lt;td class='diff-marker'&gt; &lt;/td&gt;&lt;td style=&quot;background: #eee; color:black; font-size: smaller;&quot;&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;
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			<pubDate>Wed, 27 Jun 2012 04:53:29 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 07:52, 6 June 2012</title>
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			<description>&lt;p&gt;&lt;/p&gt;

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			<pubDate>Wed, 06 Jun 2012 07:52:10 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA at 06:46, 28 December 2011</title>
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&lt;/table&gt;</description>
			<pubDate>Wed, 28 Dec 2011 06:46:05 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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			<title>OCA: Protected &quot;3uzj&quot; [edit=sysop:move=sysop]</title>
			<link>http://52.214.119.220/wiki/index.php?title=3uzj&amp;diff=1331048&amp;oldid=prev</link>
			<description>&lt;p&gt;Protected &amp;quot;&lt;a href=&quot;/wiki/index.php/3uzj&quot; title=&quot;3uzj&quot;&gt;3uzj&lt;/a&gt;&amp;quot; [edit=sysop:move=sysop]&lt;/p&gt;

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			&lt;/tr&gt;
		&lt;/table&gt;</description>
			<pubDate>Wed, 14 Dec 2011 11:16:53 GMT</pubDate>			<dc:creator>OCA</dc:creator>			<comments>http://52.214.119.220/wiki/index.php/Talk:3uzj</comments>		</item>
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