Reverse Transcriptase (Hebrew)

אנזים מתעתק במהופך (Reverse Transcriptase, להלן RT) הוא אנזים שמקורו בנגיפים, בעיקר נגיפים מקבוצת רטרווירוסים. הנגיף המפורסם ביותר הנושא את האנזים RT הוא נגיף ה-HIV הגורם לתסמונת הכשל החיסוני הנרכש (AIDS) בבני אדם. התאים המאכסנים העיקריים של הנגיף הם לימפוציטים מסוג T מסייעים (T Helpers).

אנזים זה מזרז שלוש פעולות ביוכימיות הבאות ברצף אחת אחרי השנייה. התוצאה של שלוש פעולות אלה היא העתקה של החומר הגנטי של הנגיף מ-RNA חד-גדילי ל-DNA דו-גדילי. שלוש הפעולות הן:

1. היקשרות למולקולת RNA חד-גדילית ובניית גדיל DNA משלים על גבי תבנית גדיל ה-RNA, לפי התאמה בין הנוקלאוטידים: A מול U ו-C מול G;
2. פירוק של מולקולת ה-RNA שנמצאת במבנה דו-גדילי עם גדיל DNA. כעת האנזים נותר קשור למולקולת DNA חד-גדילית בלבד;
3. בניית גדיל DNA משלים על גבי תבנית של מולקולת DNA חד-גדילי, לפי התאמה בין הנוקלאוטידים.

מולקולת ה-DNA הדו-גדילית יכולה להשתלב לתוך הגנום של התא המאכסן, ומשם לעבור תהליכים תאיים כמו שכפול ותעתוק.

האנזים התגלה בשנת 1970 על ידי הווארד טמין הווארד טמין מאוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון ברטרווירוס התוקף עכברים. באותה שנה האנזים בודד באוניברסיטת MIT מרטרווירוס אחר התוקף תרנגולות, על ידי דיויד בולטימור. השניים קיבלו פרס נובל לרפואה על הישגיהם בשנת 1975.
הקהילה המדעית התקשתה תחילה לקבל את הרעיון של תעתוק במהופך שכן הוא סותר את הדוֹגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית, לפיה קיים כיוון אחד של העברת מידע בתאים: DNA מתועתק למולקולת RNA, ומולקולת ה-RNA מתורגמת לחלבון.

אופן העברת המידע לפי הדוגמה המרכזית נצפה באורגניזמים שונים ובתנאים שונים, ולכן נתפס עד אז כבלעדי בעולם החי. אולם לאור ההוכחות שהציגו טמין ובולטימור, והעובדה שהוכחות אלה היו בלתי תלויות זו בזו ונצפו במקביל במקומות שונים בעולם, התקבלה הכרה כי קיים בעולם החי גם תעתוק במהופך.

מבנה ותפקוד האנזים

האנזים RT מורכב משתי תת-יחידות השונות זו מזו, ולכן מסווג כ (הטרו = שונה, דימר = שתי תת-יחידות). אורכו 560 חומצות אמיניות בשרשרת A ו-440 חומצות אמיניות בשרשרת B.
באנזים RT אפשר למצוא שונים: כשליש מהחומצות האמיניות נמצאות במבנה שניוני של , וכרבע מהן נמצאות במבנה שניוני של . המבנים השניוניים האלה תורמים ל של האנזים כולו. מבנה מרחבי זה מאפשר קישור לגדיל (בירוק) המשמש סובסטרט ולגדילי ה- (בתכלת) הנוצרים לפיו.
הפעילות האנזימטית של RT מתבצעת כולה על ידי שרשרת A (שרשרת B אינה פעילה אנזימטית כלל, וככל הנראה תורמת לייצוב המבנה המרחבי של האנזים). בתוך שרשרת A ישנם חמישה אזורים מוגדרים. שניים מהאזורים משתתפים בפעילות האנזימטית של RT:

• (ח"א 117-86 וח"א 236-156, מוצגות ככדורים אדומים) – אזור זה נקרא כך בשל שלו: הוא נמצא בין אזור האצבעות ובין אזור האגודל (ר' בהמשך). בתוך אזור זה נמצא האתר הפעיל של האנזים RT, ובו מתבצעת בניית גדיל DNA, הן על בסיס גדיל RNA בפעולה האנזימטית הראשונה והן על בסיס DNA בשלב השלישי. בעמדה 110 ובעמדות 185-186 נמצאת הח"א חומצה אספרטית. (בכחול) קשורות בקשר יוני ליוני מגנזיום (בוורוד) התורמים לייצוב המבנה המרחבי של האתר הפעיל. כאשר פגעו בניסויים בגן המקודד לאנזים RT וגרמו למוטציה בעמדות 110, 186-185, פעילות התעתוק-במהופך של האנזים שקודד מהגן הפגוע ירדה מאוד. בנוסף, הרצף בעמדות 235-227, המכונה (בכתום), חשוד כי הוא מעורב בייצוב מולקולת ה-DNA הנבנית ובקשירה של נוקלאוטיד נוסף אליה;

• (ח"א 427 עד סוף השרשרת, מוצגות ככדורים אדומים) – לאזור זה פעילות אנזימטית אחרת: באזור זה מתפרק גדיל ה-RNA לאחר התעתוק במהופך. גם באזור זה קשור יון מגנזיום +Mg2 בקשרים יוניים;

• אזור מוגדר נוסף בשרשרת A הוא (ח"א 426-319, מוצגות ככדורים אדומים) – באזור זה מתרחשת האינטראקציה בין שרשרת A (באדום) ושרשרת B (בוורוד). בתוך האזור נמצא רצף המכונה "מוטיב " בעמדות 414-398 (בכתום), ובו 17 חומצות אמיניות, שש מהן הן טריפטופן (החומצה האמינית הנדירה ביותר, בכחול). בניסוי שנערך הוחלפה החומצה האמינית טריפטופן שבעמדה 401 באמצעות מוטציה בגן. כאשר הטריפטופן הוחלפה בחומצה האמינית פנילאלאנין, הפעילות האנזימטית של RT כמעט ולא הושפעה. אולם כאשר טריפטופן הוחלפה בחומצה האמינית לאוצין, השרשרות A ו-B נפרדו והאנזים איבד את פעילותו;

• מוגדרים נוספים בשרשרת A הם האצבעות (חומצות אמיניות 85-1 וחומצות אמיניות 155-118, בכתום) והאגודל (ח"א 318-237, בוורוד). אזורים אלה מכונים כך בגלל הצורה המרחבית שלהם, והם נמצאים משני צדי אזור כף היד (באדום). כאשר מסתכלים על המבנה המרחבי של שלושת האזורים, הם נדמים לכף יד הלופתת את הסליל הכפול של חומצות גרעין שבמרכז האנזים.

מהימנות הפעילות האנזימטית

בעת פעולתו, האנזים RT מועד לטעויות. בניסוי שנערך נמצא כי תדירות המוטציות במולקולת ה-DNA הנוצרת הוא 1 ל-4000-2000.
משמעות הדבר היא שמתרחשת מוטציה אחת כל כשלושת אלפים נוקלאוטידים המתרכבים למולקולת ה-DNA הנוצרת. קצב המוטציות הגבוה גורם לכך שהחומר התורשתי של הנגיף משתנה כמעט עם כל הדבקה. עקב כך, מוטציות שמתרחשות במהלך פעולתו של אנזים RT גורמות לשינוי החומר הגנטי של הנגיף . דבר זה מאפשר לנגיף "להתחמק" מן המערכת החיסונית של המאכסן ולפתח עמידות נגד תרופות אנטי ויראליות זמינות כנגד ,ולכן פיתוח תרופות נגד הנגיף נתקל בקשיים רבים.

שימושים בביולוגיה מולקולרית

האנזים RT משמש במעבדות רבות בעולם ליצירת מולקולות DNA מתבנית של מולקולות RNA. מולקולת ה-DNA שמתקבלת נקראת complementary DNA או cDNA, והיא יציבה בהרבה ממולקולת ה-RNA. cDNA מסייע למדענים לחקור תהליכים בתא כמו בקרה על ביטוי גנים, ליצור ספריות DNA למחקר עתידי ואף לפתח תרופות.