מבוא
Cas9 הינו אנזים אשר חותך DNA ובעל תפקיד מפתח במערכת החיסון החיידקית CRISPR Clustered) Regularly Interspaced Short Palindromic). ה-CRISPR הינו אזור ב DNA המהווה חלק ממנגנון הגנה מפני נגיפים (וירוסים). הנגיף לא יכול לחיות באופן עצמאי לכן הוא צריך אורגניזם מארח שחודר אליו ומנצל אותו לצרכיו הביולוגיים החיוניים. אזור ה- CRISPR בגנום החיידק מכיל מקטעי DNA נגיפי שנחתכו מנגיפים שפלשו בעבר לחיידק אשר פורקו ושולבו בגנום החיידק או הארכאה בין רצפים קבועים וחוזרניים. לפיכך מהווה מערכת זו מעין מערכת "זכרון" של הדבקות קודמות ומאפשרת לתא החיידק להתגונן מפני הדבקות נגיפיות.
מנגנון ההגנה מורכב ממספר מרכיבים: חלבון בעל יכולת חיתוך DNA הקרוי Cas (לדוגמא החלבון: (Cas9 ומולקולת RNA קצרה המתבטאת מאזור ה-CRISPR ב DNA שנקראת single guide RNA (sgRNA). כאשר וירוס מדביק חיידק, מולקולת ה- sgRNA נקשרת לחלבון ה Cas וקומפלקס זה נקשר ל DNA הנגיפי על סמך התאמה רצפית בין מולקולת ה sgRNA והDNA הויראלי. האנזים חותך את הרצף של הDNA של הווירוס ובכך לא יוכל לייצר חלבונים ולהתרבות וכתוצאה מכך הווירוס מנוטרל .
Cas9 מבנה ופעילות
החלבון Cas9 הינו חלבון בעל פעילות של נוקלאז (יכולת חיתוך חומצות גרעין ) ומהווה מעין "מספריים מולקולריות ". ספציפיות החיתוך של ה Cas9 נקבעת ע״י ה- sgRNA.
בערך זה מוצג החלבון Cas9 שמקורו מהחיידק Staphylococcus aureus אשר גובש יחד עם מולקולות
, כאשר הsgRNA בצבע חום ו- DNA בצבע אדום.
החלבון Cas9 מורכב מ- 1057 והוא בעל שהם סלילי אלפא ומשטחי בטא .
עם הקשרות החלבון למולקולת הsgRNA, מתרחשים שינויים במבנה השלישוני שלו היוצרים שני אזורים מבניים, אזור NUC ואזור REC , אשר יוצרים בניהם תעלה המאפשרת לחלבון להקיף את תצמיד ה sgRNA ומולקולת ה DNA המיועדת לחיתוך. אזור ה NUC אחראי על פעילות חיתוך ה DNA. עמדות 10ו- 557 המצויות באזור זה מהוות את -האזור בחלבון בו מתרחשת התגובה הכימית של חיתוך ה DNA. החלבון כולל מספר שיירים חשובים נוספים. למשל, בעמדה 789 קיימת חומצת אמינית החשובה לזיהוי רצף קצר של 3 בסיסים ב DNA הקרוי PAM והוא חיוני לפעילות החיתוך. כמו כן, עמדות 10,477,481,701 הינן אתרי , חשיבות יוני המגנזיום בחלבון היא להיווצרות ויציבות האתר הפעיל.
במחקר וברפואה CRISPR-שימוש ב
כיום, מערכת ה- CRISPR משמשת במחקר ובתחום הרפואה כטכנולוגיה לעריכת הגנום.
ישנם שני אופנים נפוצים לעריכה גנומית בעזרתCRISPR . הראשון הוא שיבוש הרצף הגנומי- שעשוי להוביל לאובדן ביטוי מוחלט של גן המטרה. בעקבות חיתוך הDNA ויצירת שבר במולקולת הDNA (double strand break), הDNA עובר תיקון תוך כדי הוספה החסרה רנדומלית של נוקלאוטידים, מה שעלול ליצור שינוי של מסגרת הקריאה והופעת קודון סיום מוקדם. האופן השני הוא שינוי מוגדר בגנום המוביל לשינוי תוצר הגן. שינוי זה מתאפשר ע״י הוספה של מולקולת DNA זהה לגן המטרה המכילה את השינוי הרצוי. תיקון הDNA במקרה זה מתרחש ברקומבינציה הומולוגית. שינויים אפשריים הם החלפת סוג הבסיס, הוספה או החסרה של מקטע. ה- CRISPR, לעומת טכנולוגיות עריכה גנומית אחרות, מאפשר עריכת גנים ביעילות משמעותית.
