User:Clara Fernández Vidal/Isocitrato deshidrogenasa

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1 Isocitrato deshidrogenasa: escenas 3D para la comprensión de su función y estructura

Isocitrato deshidrogenasa: escenas 3D para la comprensión de su función y estructura

El objetivo de la publicación de este artículo fue enriquecer con escenas 3D la bibliografía existente sobre la conocida enzima isocitrato deshidrogenasa (IDH) de manera que se pudieran observar mejor las interacciones de los ligandos con la enzima, así como entender los cambios conformacionales que causan las mutaciones en los centros activos de esta. En otras palabras, se demostró con la visualización 3D una mejora en el estudio de estructura y función de biomoléculas.

Criterios de búsqueda en Protein Data Bank (PDB)

Se procedió a estudiar la Isocitrato deshidrogenasa (IDH) a partir de bibliografía existente. Primeramente, se hizo una búsqueda en PDB ^[1] con el término de isocitrate dehydrogenase y se filtró para seleccionar solo aquellas enzimas que fueran pertenecientes a Homo sapiens; aparecieron 16 resultados que son los que se recogen en la Tabla 1.

Tabla 1. Listado de resultados basados en la búsqueda de isocitrate dehydrogenase en PDB filtrando por Homo sapiens. Las estructuras sombreadas son las utilizadas en este estudio.

Los códigos de PDB de las enzimas con las que se trabajó fueron: 1T09,1T0L y 3MAS por la accesibilidad a la bibliografía y el interés de su contenido.

La enzima y sus isoformas

La IDH es una importante enzima en el metabolismo celular humano formando parte del ciclo de Krebs, catalizando la descarboxilación oxidativa del isocitrato (ICT) en α-cetoglutarato (αKG). Las células humanas expresan al menos tres IDH diferentes: IDH1, IDH2 e IDH3.

La IDH1 es dependiente de NADP y está ubicada en el citosol, la IDH2 se ubica en la matriz mitocondrial y es dependiente de NADP, es muy parecida estructuralmente a la IDH1 y, por último, la IDH3 utiliza NAD como cofactor en la matriz mitocondrial.^[2] ^[3] ^[4]. Véase a continuación la Tabla 2 que resume lo descrito.

Tabla 2. Características comparadas de las tres isoformas de la enzima IDH.

Este estudio se centró en la isoforma IDH1 debido a que su estructura dimérica era más simple, existía información acerca de las mutaciones que sufre y por ello encajó mejor con el objetivo de añadir escenas 3D que permitieran enriquecer los artículos consultados.

1 Estructura de la IDH1 y sitio activo
- 1.1 Conservación evolutiva
- 1.2 Estudio de la estructura
2 Mutación en la Arg132 y su relación con el cáncer

Estructura de la IDH1 y sitio activo

La IDH1, con código 1T09 en PDB, tiene como ligando NADP y por lo tanto forma un complejo binario IDH1-NADP.

Existe otra IDH1 con código 1T0L en PDB, que contiene tres ligandos: ICT, NADP y Ca2+, por lo que forma un complejo cuaternario: IDH1- ICT-NADP-Ca2+. Su estructura contiene cuatro subunidades etiquetadas como cadenas A, B, C y D, aunque corresponden a dos copias en la simetría del cristal de la enzima dimérica (con cadenas A y B). La forma fisiológica funcional de la enzima ODH1 es un homodímero. No obstante, como se mostrará, las dos subunidades pueden adoptar conformaciones ligeramente diferentes entre sí.

Sin importar el número de subunidades que presente cada una de las estructuras de IDH1 (1T09 complejo binario y 1T0L complejo cuaternario), las dos estructuras presentan tres dominios:

Dominio grande (L): residuos 1-103 y 286-414.
Dominio pequeño (S): residuos 104-136 y 186-285.
Dominio clasp (C): residuos 137-185.

Además, una parte del dominio pequeño constituye el llamado péptido regulador, cuya conformación varía en relación con la ocupación del sitio activo. Este péptido regulador consta de residuos 271-286 en el sitio activo, está representado en naranja en el Esquema 1.^[2]

Esquema 1. Representación de los dominios de la IDH1. Creación propia en Biorender.

La conformación de la subunidad A (rojo) en el complejo binario (IDH-NADP) se parece más a la forma abierta. Xiang Xu et al ^[2] proponen que la conformación abierta de IDH puede corresponder a la forma inactiva de la enzima.

La conformación de IDH de la subunidad B (azul) del complejo binario (IDH-NADP) está entre la forma abierta y la cerrada. Proponen que la forma semiabierta de la IDH puede representar una forma intermedia entre la conformación activa y la inactiva.

Conservación evolutiva

Se procedió al estudio de la conservación evolutiva de la isocitrato deshidrogenasa. Se representó:

la enzima dimérica con código PDB 1T09, con el ligando NADP en verde brillante
la cadena A de la enzima con código PDB 1T09, coloreada según su conservación evolutiva y el ligando NADP en verde brillante.

Estudio de la estructura

1. Superposición de las subunidades A y B de IT09

Se quiso observar el cambio conformacional de abierta a semiabierta por lo que se hizo un alineamiento jFATCAT flexible y dio como resultado un RMSD de 0.95, lo cual indicó que había muy pocas diferencias entre una subunidad y la otra.

Lo interesante de esta escena es que permitió ver el cambio conformacional de abierta (cadena A) a semiabierta (cadena B). También se aprecia el desplazamiento del péptido regulador (destacado con tonalidades más oscuras en cada una de las representaciones).

2. Superposición de las cadenas A de 1T09 y 1T0L

El objetivo de esta escena fue poder observar el cambio conformacional del péptido regulador cuando entran los ligandos ICT y Ca2+ en el complejo cuaternario.

Se hizo un alineamiento entre las cadenas A de 1T09 y 1T0L jFATCAT rígida, lo cual resultó en un RMSD de 3.78 Angstroms, valor que indica ciertos cambios en las estructuras que observamos en la escena.

La conformación inactiva es la cadena A de la 1T09 (complejo binario); la conformación activa es la cadena A de la 1T0L (complejo cuaternario)con ICT en blanco y Ca2+ en cian. NADP amarillo y péptido regulatorio en naranja en ambas conformaciones. Los colores de los dominios se mantienen de acuerdo con las anteriores escenas.

Además, el modelo de trabajo de Xiang Xu et al^[2] postula que la IDH puede utilizar el segmento regulatorio y las interacciones de Asp279 (morado) con Ser94 (verde pistacho) para inactivar la enzima, lo cual se comprueba con la escena 3D puesto que se observó que al entrar ICT y Ca2+, la proteína reguladora cambia de conformación al igual que lo hacen Asp279 y Ser94. ^[2]

La unión competitiva del isocitrato induce el replegamiento de la proteína reguladora y los cambios conformacionales generales y consecuentemente para activar la enzima.

3. Alineamiento 1T09 con 1T0L, cadenas A

Se visualiza el cambio conformacional del cierre de la proteína cuando entran los ligandos. Con el alineamiento de la proteína entera hecho anteriormente, no se observa tan claramente el cambio conformacional de cierre cuando entra el ligando.

En esta nueva escena, se planteó hacer el alineamiento dejando solo el dominio grande puesto que se vio que no sufre cambios conformacionales con la unión del ligando. Como dicho dominio grande está formado por dos segmentos no consecutivos en la secuencia, la plataforma de alineamiento no nos permite alinear todo el segmento, por lo que hicimos sendos alineamientos con cada una de las dos mitades que mostraron un RMSD menores de 1 A, esto indica que no hay cambios conformacionales internos en el dominio como consecuencia de la unión del ligandos ICT y Ca2+. Por lo tanto, se utilizaron para el alineamiento de las cadenas A de 1T09 y 1T0L, haciendo el alineamiento sobre los residuos 286-414.

4. Interacción Arg132 con ICT

Se quiso demostrar la interacción entre el ligando ICT y la Arg132; con el siguiente comando: contact {ICT} full connect se buscaron los contactos del ICT (blanco) en Jmol, y como se esperaba, aparecieron los 15 contactos que se describieron Xiang Xu et al ^[2]. Se utilizó para las dos escenas siguientes la molécula en PDB 1T0L. ^[2]

Thr77, Ser94, Arg100, Arg109, Arg132, Tyr139, y Asp275 en una subunidad
Lys212, Thr214, y Asp252 en la subunidad adyacente
3 moléculas de agua, NADP y Ca2+

Tabla 3.Interacciones de los diferentes carbonos de ICT.

Esquema 3. Representación del esqueleto de carbonos de ICT y su nomenclatura original de PDB comprobada en Jmol. Creación propia en Biorender.

Mutación en la Arg132 y su relación con el cáncer

Se ha descubierto que la isoenzima IDH1 citosólica humana está implicada en la tumorigénesis. En particular, las mutaciones IDH1 derivadas de tumores identificadas ocurren principalmente en Arg132, y la mutación R132H es la más prevalente.

Arg132 desempeña múltiples funciones funcionales en la reacción catalítica; en particular, la mutación R132H dificulta los cambios conformacionales desde el estado inicial de unión a las ICT al estado previo a la transición, lo que lleva al deterioro de la actividad IDH.^[2]

Las mutaciones en la enzima causan la aparición de una nueva actividad catalítica que provoca la conversión de alfa-cetoglutarato (α-KG) en 2-hidroxiglutarato (2-HG), que desregula un conjunto de dioxigenasas dependientes de α-KG. Específicamente, debido a la estructura similar entre 2-HG y α-KG, 2-HG bloquea competitivamente la unión de α-KG a histonas desmetilasas, como la desmetilasa específica de lisina (KDM), y luego aumenta la metilación de histonas. El 2-HG también inhibe la actividad de diez a once hidroxilasas de translocación, que son importantes para la metilación global del ADN.

Por otro lado, los altos niveles de 2-HG debido a las mutaciones de IDH, estabilizan el factor HIF alfa debido a que disminuyen los niveles de una endostatina de HIF-1α lo cual resulta en la upregulación de los genes dependientes de la endostatina HIF-1α, que incluyen el VEGF factor de crecimiento vascular endotelial. ^[5] ^[6]

La molécula que se usó para el estudio de la mutación Arg132 (R132H) fue la IDH1 con código PDB 3MAS, con ligandos ICT y Ca2+.

Esta escena pretendió demostrar el cambio de conformación que se da en la enzima con la mutación Arg132 de 3MAS en la cadena A frente a 1T0L en la cadena A, alineando la segunda mitad del dominio grande, es decir, los residuos de 286-414, con un RMSD de 0.65.

Arg132 (rojo en 1T0L) e His (morado en 3MAS). ICT en blanco. Se observó lo que más tarde se comprobó, ICT no hace contacto con His y sí con Arg132.

Con el codigo: contact {ICT} {Arg132} full connect, se exploraron los contactos entre el ligando ICT y la Arg132. La escena representa el contacto entre ICT (blanco) y Arg132 (rojo). Se mantuvo el código de colores del resto de la molécula.

Se puede ver en la conformación mutada que están muy lejos ICT (blanco) e His132 (morado) como para hacer contacto. Al evaluar si existe contacto entre ICT e His132, con el siguiente código: contact {ICT} {His132} full connect, como era de esperar, aparecen 0 resultados. También se puede observar de nuevo en ambas imágenes el cambio conformacional que sufre el péptido regulador (naranja).

Siguiendo con el estudio de los contactos y empleando esta línea de código en Jmol: contact {ICT} full connect, para estudiar todos los contactos de ICT, se observa que aparecen 27 contactos; hay contactos nuevos con la mutación comparando con los que existían antes sin la mutación de Arg132 (15 contactos).

El comando full connect muestra los contactos de ICT contra todo lo demás, es decir, proteína, otros ligandos, etc.

En cuanto al péptido regulador su posición no se ha resuelto al analizar la estructura cristalina, en ninguno de los tres modelos 3MAS/3MAP/3MAR, esto indica que su conformación es variable, al contrario de lo que ocurre en el modelo no mutado.

Distintas conformaciones pueden representar diferentes estados enzimáticos

Los dos complejos (binario y cuaternario) presentan tres conformaciones diferentes. La conformación general del complejo cuaternario se parece a la cerrada. La zona activa puede adoptar una conformación compacta o cerrada. En la evidencia, sugirieron que las diferencias conformacionales de los segmentos regulatorios en los tres conformadores de IDH estaban probablemente relacionadas con las funciones biológicas de la enzima y que las distintas conformaciones de IDH observadas en las dos estructuras complejas eran biológicamente relevantes, pudiendo representar diferentes estados enzimáticos.^[2]

Conclusión

Se muestra en este trabajo la gran utilidad de las representaciones en 3D para biomoléculas complejas en publicaciones científicas. La visualización en 3D permite acercarse a las estructuras para así entender mejor su composición y función, así como las uniones con sus ligandos y sus cambios conformacionales; cosas que en formato 2D, el único posible en imágenes de publicaciones tradicionales, a menudo se escapan.

References

↑ Protein Data Bank in Europe (PDBe). (n.d.). Recuperado de: https://www.ebi.ac.uk/pdbe/
↑ ^2.0 ^2.1 ^2.2 ^2.3 ^2.4 ^2.5 ^2.6 ^2.7 ^2.8 Yang B, Zhong C, Peng Y, Lai Z, Ding J. Molecular mechanisms of "off-on switch" of activities of human IDH1 by tumor-associated mutation R132H. Cell Res. 2010 Nov;20(11):1188-200. doi: 10.1038/cr.2010.145. Epub 2010 Oct 26. PMID: 20975740.
↑ Xu X, Zhao J, Xu Z, Peng B, Huang Q, Arnold E, Ding J. Structures of human cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase reveal a novel self-regulatory mechanism of activity. J Biol Chem. 2004 Aug 6;279(32):33946-57. doi: 10.1074/jbc.M404298200. Epub 2004 Jun 1. PMID: 15173171.
↑ Chen X, Yang P, Qiao Y, Ye F, Wang Z, Xu M, Han X, Song L, Wu Y, Ou WB. Effects of cancer-associated point mutations on the structure, function, and stability of isocitrate dehydrogenase 2. Sci Rep. 2022 Nov 5;12(1):18830. doi: 10.1038/s41598-022-23659-y. PMID: 36335201; PMCID: PMC9637083.
↑ Bleeker FE, Lamba S, Leenstra S, Troost D, Hulsebos T, Vandertop WP, Frattini M, Molinari F, Knowles M, Cerrato A, Rodolfo M, Scarpa A, Felicioni L, Buttitta F, Malatesta S, Marchetti A, Bardelli A. IDH1 mutations at residue p.R132 (IDH1(R132)) occur frequently in high-grade gliomas but not in other solid tumors. Hum Mutat. 2009 Jan;30(1):7-11. doi: 10.1002/humu.20937. PMID: 19117336.
↑ Chen X, Ding J. Molecular insights into the catalysis and regulation of mammalian NAD-dependent isocitrate dehydrogenases. Curr Opin Struct Biol. 2023 Oct; 82:102672. doi: 10.1016/j.sbi.2023.102672. Epub 2023 Aug 3. PMID: 37542909

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 La conformación inactiva es la cadena A de la 1T09 (complejo binario); la conformación activa es la cadena A de la 1T0L (complejo cuaternario)con ICT en blanco y Ca2+ en cian. NADP amarillo y péptido regulatorio en naranja en ambas conformaciones. Los colores de los dominios se mantienen de acuerdo con las anteriores escenas.
-Además, el modelo de trabajo de ''Xiang Xu et al'' <ref name="ref2"/> postula que la IDH puede utilizar el segmento regulatorio y las interacciones de Asp279 (morado) con Ser94 (verde pistacho) para inactivar la enzima, lo cual se comprueba con la escena 3D puesto que se observó que al entrar ICT y Ca2+, la proteína reguladora cambia de conformación al igual que lo hacen Asp279 y Ser94. <ref name="ref2"/>
+Además, el modelo de trabajo de ''Xiang Xu et al''<ref name="ref2"/> postula que la IDH puede utilizar el segmento regulatorio y las interacciones de Asp279 (morado) con Ser94 (verde pistacho) para inactivar la enzima, lo cual se comprueba con la escena 3D puesto que se observó que al entrar ICT y Ca2+, la proteína reguladora cambia de conformación al igual que lo hacen Asp279 y Ser94. <ref name="ref2"/>
 La unión competitiva del isocitrato induce el replegamiento de la proteína reguladora y los cambios conformacionales generales y consecuentemente para activar la enzima.
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 '''4. Interacción Arg132 con ICT'''
-Se quiso demostrar la interacción entre el ligando ICT y la Arg132; con el siguiente comando: ''contact {ICT} full connect'' se buscaron los contactos del ICT (blanco) en Jmol, y como se esperaba, aparecieron los 15 contactos que se describieron ''Xiang Xu et al'' <ref name="ref2"/>. Se utilizó para las dos escenas siguientes la molécula en PDB 1T0L.
+Se quiso demostrar la interacción entre el ligando ICT y la Arg132; con el siguiente comando: ''contact {ICT} full connect'' se buscaron los contactos del ICT (blanco) en Jmol, y como se esperaba, aparecieron los 15 contactos que se describieron ''Xiang Xu et al'' <ref name="ref2"/>. Se utilizó para las dos escenas siguientes la molécula en PDB 1T0L. <ref name="ref2" />
 *Thr77, Ser94, Arg100, Arg109, Arg132, Tyr139, y Asp275 en una subunidad
 *Lys212, Thr214, y Asp252 en la subunidad adyacente
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 Se ha descubierto que la isoenzima IDH1 citosólica humana está implicada en la tumorigénesis. En particular, las mutaciones IDH1 derivadas de tumores identificadas ocurren principalmente en Arg132, y la mutación R132H es la más prevalente.
-Arg132 desempeña múltiples funciones funcionales en la reacción catalítica; en particular, la mutación R132H dificulta los cambios conformacionales desde el estado inicial de unión a las ICT al estado previo a la transición, lo que lleva al deterioro de la actividad IDH.<ref name="ref2"/>
+Arg132 desempeña múltiples funciones funcionales en la reacción catalítica; en particular, la mutación R132H dificulta los cambios conformacionales desde el estado inicial de unión a las ICT al estado previo a la transición, lo que lleva al deterioro de la actividad IDH.<ref name="ref2" />
 Las mutaciones en la enzima causan la aparición de una nueva actividad catalítica que provoca la conversión de alfa-cetoglutarato (α-KG) en 2-hidroxiglutarato (2-HG), que desregula un conjunto de dioxigenasas dependientes de α-KG. Específicamente, debido a la estructura similar entre 2-HG y α-KG, 2-HG bloquea competitivamente la unión de α-KG a histonas desmetilasas, como la desmetilasa específica de lisina (KDM), y luego aumenta la metilación de histonas. El 2-HG también inhibe la actividad de diez a once hidroxilasas de translocación, que son importantes para la metilación global del ADN.