Alkaline phosphatase (Hebrew)
From Proteopedia
Contents |
(Alkaline phosphatase- ALP) אלקליין פוספטאז
|
החלבון אלקליין פוספטאז משתייך לקבוצת הפוספטאזות. פוספטאזות הם אנזימים המזרזים הסרת קבוצת פוספט (דה-פוספורילציה) ממולקולות אורגניות בתהליך הידרוליזה , כלומר פירוק קשר הפוספט נעשה תוך תגובה עם מולקולת מים.
פעולת הפוספטאז הינה הפעולה ההפוכה מזו של הקינאז המוסיף קבוצת פוספט למולקולות שונות (פוספורילציה).
הפוספטאזות מתחלקות לפוספטאזות חומציות ובסיסיות בהתאם לרמת הpH בה מתרחשת פעילות אופטימלית של האנזים. פעילותו של אלקליין פוספטאז, הקרוי גם פוספטאזה בסיסית, מתבצעת ברמת pH בין 8 ל 10, כתלות באורגניזם שממנו בודד האנזים.
פעילותו של האלקליין פוספטאז היא בלתי ספציפית, כלומר הינו בעל יכולת לבצע דה פוספורילציה למגוון מולקולות- לנוקליאוטידים וחלבונים שונים.
מבנה המולקולה
האנזים הוא דימר ובנוי מ .
של החלבון כולל סלילי אלפא (המוצגים בצבע ורוד) ומשטחי בטא (המוצגים בצבע צהוב).
כל יחידה מורכבת משרשרת חלבונית שאורכה 471 חומצות אמינו, כאשר 21 החומצות האמיניות שבקצה ה-N טרמינלי של החלבון מהוות סיגנל-פפטיד, שלא נכלל בתצוגת
החלבון. שאר הרצף, הכולל את הבאות, מרכיב את השרשרת החלבונית.
סיגנל-פפטיד הינו רצף חומצות אמינו הקיים בחלבונים ממברנליים ומזוהה על ידי חלבון ייחודי (SRP) שעוצר את התרגום ומוביל את החלבון הנוצר אל הER להמשך תרגום, ומשם יועבר החלבון למיקומו בממברנת התא או להפרשה מחוץ לתא.
המבנה המרחבי של החלבון כולל שני קשרים די-סולפידים. האתר הפעיל, המצוי בכל אחת מתתי היחידות, מורכב מחומצה אמינית יחידה, החומצה האמינית סרין המצויה בעמדה 124. הכיס הקטליטי מכיל גם יון מגנזיום ושני יוני אבץ הנקשרים לחומצות אמינו סמוכות, המצויות ברובן בעמדות שמורות כמו עמדת האתר הפעיל.
פעילות קטליטית
האנזים אלקליין פוספטאז מסיר קבוצות פוספאט ממולקולות מזורחנות וכתוצאה מכך נוצרת מולקולה כהלית וקבוצת פוספט חופשית.
יון מגנזיום ושני יוני אבץ משמשים כקו-פקטורים הנדרשים לצורך יציבות ופעילות של האנזים. האנזים , הפועל כמעכב תחרותי החוסם את הכיס הקטליטי מקשירת סובסטרט.
אלקליין פוספטאז בגוף האדם
ברקמות שונות בגוף ישנן צורות שונות, איזואנזימים שונים של אלקליין פוספטאז, הנבדלים ביניהם במספר מדדים, כולל הבדלים במשקלם המולקולארי שנע בין 70 ל-120 קילודלטון. הרקמות העיקריות בהן נמצאה פעילות משמעותית של אלקליין פוספטאז הן: כבד, עצמות השלד, שליה, מעיים, כליות, טחול וריאות.
רמת אלקליין פוספטאז בדם מוערכת בבדיקות סקר וניתן באמצעות מדד זה לבדוק תפקודי כבד ולאבחן מחלת כבד, מפגעי עצמות או חסימות בדרכי המרה. כאשר יש פגיעה בתאים, משתחרר מהם האנזים ורמתו בדם עולה. כאשר יש עליה ברמת אלקליין פוספטאז בדם, מדידת האיזואנזימים השונים יכולה להצביע על האיבר הנפגע שממנו השתחרר האנזים.
אנזים זה מעורב גם בבניית העצם, כך שגם בתהליך גדילה יש עליה של רמת האנזים בדם.
האנזים מקובע בקצה ה-C טרמינלי לממברנות התאים בהם הוא מתבטא. בעקבות הוספת פוספט לחלבון מטרה (באמצעות קינאז) או הסרתו (באמצעות פוספטאזה), מתרחש מעבר של חלבון המטרה ממצב פעיל למצב לא פעיל, ולהיפך. כיוון שכך, פעילותו של האנזים בהסרת פוספט מחלבונים שונים משפיעה על שפעול תהליכים שונים בתא.
אלקליין פוספטאז במחקר
אלקליין פוספטאז משמש במעבדה להסרת פוספט ממולקולות שונות.
כך למשל, על מנת להחדיר מקטעי דנ"א שונים לתוך פלסמידים (תהליך הקרוי שיבוט) לצורכי הנדסה גנטית בחיידקים, נעשה שימוש באלקליין פוספטאז. לשם כך, מבצעים חיתוך של הפלסמיד באתר שבו מעוניינים להחדיר את מקטע הדנ"א הרצוי (המחדר). לאחר מכן, על מנת להבטיח שאחוז גבוה של הפלסמידים החתוכים יקלטו את המחדר, מוסיפים אלקליין פוספטאז לתמיסה המכילה את הפלסמידים החתוכים (מקטעים ליניאריים) והאנזים אלקליין פוספטאז מסיר קבוצות פוספאט מהקצוות של הפלסמיד החתוך (מהנוקליאוטיד שבקצה ה-5'). כתוצאה מכך, כאשר יעורבבו מולקולות הפלסמיד שטופלו באלקליין פוספטאז עם המחדרים, בתוספת האנזים ליגאז, תתאפשר סגירה של מולקולת הפלסמיד לצורתה המעגלית רק בתוספת המחדר המכיל בקצהו את קבוצת הפוספט הנדרשת ליצירת הקשר הפוספודיאסטרי בין הנוקליאוטידים על ידי הליגאז. להלן סרטון הממחיש את התהליך.
שימוש נפוץ נוסף באלקליין פוספטאז במעבדה הוא לצורך קביעת רמת ביטוי של גן נחקר.
הגן phoA, שמקורו ב- Escherichia coli, מקודד לאלקליין פוספטאז ומשמש במחקר כגן מדווח המוחדר לתאים בשיטות של הנדסה גנטית. יכולתו של האנזים להקשר ולהסיר פוספט מטווח רחב של חומרים, מאפשרת למדוד את פעילותו על ידי שימוש בסובסטרטים שונים המשנים את אופיים לאחר הסרת הפוספט.
הסיגנל הנמדד לפעילות משתנה בהתאם לסובסטרט- הסיגנל יכול להיות אלקטרוכימי, כולורימטרי ,פלורסנטי ועוד.
כך למשל סיגנל כולורמטרי מתקבל בנוכחות הסובסטרט pNPP: p-nitrophenyl phosphate . בעקבות הפעילות האנזימטית, מתקבל התוצר p-nitrophenol שהינו חומר בצבע צהוב שניתן למדוד את עוצמת הבליעה שלו המעידה על רמת הביטוי של הגן phoA.
כאשר הגן
phoA מוחדר לתא בסמוך לגן נחקר או לאזור הבקרה של גן נחקר, רמת הביטוי מעידה על מידת ביטוי הגן הנחקר בתנאים הנבדקים.
