Sandbox-hmmam

Jump to: navigation, search

משפחה של חלבונים מסוג גליקופרוטאינים, הנקשרים ל בחוזקה. החלבון מהווה אחוז קטן מחלבון הביצה של זוחלים, עופות ודו-חיים וכן קיים בחיידקים וביצורים נוספים. הקישור הספציפי של האבידין לביוטן אפשר את השימוש באבידין ככלי במחקרים רבים, בשל הקישור החזק בין הביוטין לאבידין, שהוא אחד מהקישורים הלא קוולנטיים החזקים ביותר בטבע אשר יוצר קומפלקס יציב שנקרא קומפלקס האבידין-ביוטן, החלבון פעיל בטווח רחב של טמפרטורות ו-pH.

רוב החלבונים שהתגלו ממשפחה זו הם טטראמרים, חלבונים שלהם 4 תת-יחידות זהות, אולם קיימים במשפחת חלבונים זו גם . כל אחת מהיחידות הזהות בטטראמר ובדימר, יכולה לקשור מולקולת ביוטן אחת בזיקה גבוהה מאוד, עם קבוע דיסוציאציה שבסביבות ≈10−15. זיקה זו היא אחת הזיקות הלא קוולנטיות החזקות ביותר שקיימות בטבע].

האבידין הוא גליקופרוטאין , ומבנה כל אחת מהיחידות המרכיבות את האבידין הוא של חבית בטא (beta barrel), הבנויה משמונה אנטי-מקבילים ומעט סלילי אשר לא משפיעים על המבנה. האתר הפעיל של החלבון נמצא באזור הנקבובית של חבית הבטא. החלבון שמקורו בביצי תרנגולות מונה 128 חומצות אמינו, ו-10% ממשקלו מורכב מסוכר, עובדה שהופכת את החלבון למסיס מאוד. לחלבון זה נקודה איזואלקטרית הנמצאת בין pH 10–10.5.

הדיאגרמה המצורפת הינה עבור חלבון האבידין. אפשר ע"פ הדיאגרמה לזהות שהמבנה השניוני של החלבון מורכב ברובו ממשטחי ביטה וגם מורכב ממעט אלפא הילקס. בדיאגרמה ניתן לזהות שרוב חומצות האמיניות בחלבון נמצאות באיזור המותר למצב שניוני ביטא ומעט מאוד חומצות אמיניות בחלבון נמצאות באיזור המותר לאלפא הליקס. מצב זה תואם את מה שתואר על מבנה החלבון שמורכב מ 4 יחיודות (במקרה של טטראמר) או 2 יחידות (במקרה של דימיר), כאשר כל יחידה מורכת מחבית ביטא אשר מורכבת משמונה משטחי ביטא אנטי מקבילים.

ביוטן הוא ויטמין (ויטמין H, ויטמין B7 , קואנזים R ), נמצא בכמויות קטנות בתאי החיים . הביוטן קריטי למספר תהליכים ביולוגיים הכוללים צמיחת תאים ומעגל החומצה הציטרית. ביוטין מצוי בשפע בצמחים כגון גרעיני תירס, חלמון ביצה, מוח, כבד ודם ונמצא גם ברקמות של חיות . ביוטין מורכב משתי טבעות מאוחות: טבעת אוראידו (Ureido) המכילה שני אטומי חנקן וטבעת טטראהידרותיופן (Tetrahydrothiophene) המכילה אטום גופרית. לטבעת השנייה קשורה חומצה קרבוקסילית קטנה - חומצה פנטנואית - המכילה חמישה אטומי פחמן.

האנטראקציה של ביוטן ואבידין נוצלה לשימוש בזיהוי של הרבה חלבונים וחומצות גרעין וגם בהרבה שיטות לניקוי חלבונים. מולקולת הביוטן, ובגלל היותה קטנה ויציבה אינה מפריע לתפקוד החלבון אליו נקשרת. הקישור אבידין-ביוטן מנוצל לשימוש בפיתוח בדיקות שונות בדרגת רגישות מאוד גבוהה.

אבידין הוא חלבון המופק משני עופות ודו חיים, מה שמראה על אפיניות גבוהה לביוטן . לאבידין יש יכולת לקשור 4 מולקולות ביוטן כפי שמראה הציור למטה והאנטראקציה נחשבת לאידיאלית באסטרטגיות הזיהוי והניקוי של חלבונים וחומצות גרעין .

האפיניות של ביוטן להיקשר לאבידין היא מאוד גבוהה. במילים אחרות, הקישור בין הביוטן לרצפטורים של האבידין הוא מאוד חזק ואפילו בשטיפה של הקומפלקס שנוצר לא ניתן יהיה להפריד ביניהם.

ELISA  : היא שיטה ביוכימית לגילוי נוכחות נוגדנים או אנטיגן בדגימה. את הבדיקה מבצעים על ידי קשירת אנזים לנוגדן או לאנטיגן, הנצבע אחר כך בתגובה כימית. שיטת זו נחשבת לשיטה המדויקת ביותר לגילוי אנטיגנים ונוגדנים. לשיטה אלפי שימושים קליניים, מחקריים וסביבתיים כגון: מציאת דם בשתן, אבחון של נוגדנים בסרום (כמו בבדיקת HIV), גילוי הורמונים בבדיקת הריון, בדיקת סמים בדם, גילוי יצורים מיקרוסקופיים במקווה מים ועוד.

EMSA : היא שיטה נפוצה בביולוגיה מולקולרית המשמשת לחקר הקשר בין חלבונים לרצפי DNA או RNA. בעזרת השיטה ניתן לקבוע האם חלבון או אוסף חלבונים נקשר לרצף DNA או RNA (חומצת גרעין) מסוים ולעתים אף ניתן לקבוע האם יותר מחלבון אחד מעורב בקומפלקס הקישור.

השיטה מבוססת על הרצת החומרים הנבדקים דרך ג'ל למשך זמן קצר (כשעתיים עבור מקטע ג'ל באורך 20 ס"מ). המהירות שבה מולקולות שונות עוברות דרך ג'ל נקבעת על פי גודלן והמטען החשמלי שעליהן. רצועת הבקרה (בה מריצים חומצת גרעין עירומה) תראה פס במקום אליו הגיעה המולקולה ללא החלבון הנבדק. במידה והחלבון נקשר לחומצת הגרעין, הרצועה שבה הורץ החלבון, תראה פס גבוה יותר המשקף את המקום אליו הגיע הקומפלקס של החלבון יחד עם חומצת הגרעין. מכיוון שקומלפקס זה גדול יותר מחומצת גרעין עירומה הוא נע לאט יותר בג'ל ומגיע פחות רחוק ברצועה

תספיג חלבון : Western Blot : תספיג חלבון הוא שיטה לזיהוי חלבון מטרה בדוגמת חלבונים המופקת ממקורות מומסים שונים כגון נוזלים מן החי (סרום, פלזמה, שתן וכדומה) או ממבנים מן החי שעברו הומוגניזציה לשחרור הנוזלים הכלואים בהם (איברים בבעלי חיים, תאים מתרבית רקמה או מנוזלים ביולוגים וחיידקים).

לפי שיטה זו החלבונים מופרדים על גבי ג'ל באלקטרופורזה בהתאם למשקלם המולקולרי (בג'ל מצמית) או בהתאם למטענם החשמלי והמבנה המרחבי שלהם (בג'ל לא מצמית או תם). לאחר מכן מועברים החלבונים לקרום ניטרוצלולוז או PVDF על ידי הפעלת כוח חשמלי. גלוי החלבון נעשה על ידי נוגדן ייחודי לחלבון המטרה. הנוגדן מאפשר את גילוי החלבון על ידי תגובה כימית.

1.Green N.M. (1963). Avidin. 3. The Nature of the Biotin-Binding Site. Biochem J. 89:599–609.

Bayer, E. A., Viswanatha, T., and Wilchek, M. (1975) The use of a homologous series of affinity labeling reagents in the study of the biotin transport system in yeast cells. FEBS Lett. 60, 309-312.

Bayer, E. A. and Wilchek, M. (1994). Modified avidins for application in avidin-biotin technology: an improvement on nature. In Egg Uses and Processing Technologies (J. S. Sim and S. Nakai, ed.), pp. 158-176. CAB International, Wallingford, UK.