User:Carolina Castro Hernández/TFG/Parte2
From Proteopedia
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5. Estructura y función de la glicoproteína gp120
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La glicoproteína gp120 consta de unos 480 aminoácidos. La cadena polipeptídica un dominio interior y otro exterior, aproximadamente paralelos entre sí, conectados por una β-lámina de cuatro hebras antiparalelas, denominada “la lámina puente” (the bridging sheet, en inglés). La se compone de cinco regiones constantes (C1-C5) y cinco lazos variables (V1-V5) (Dragic, 2001). En el domino interior se encuentran los extremos N- y C-terminal y el bucle V1/V2. El extremo proximal del domino exterior incluye los lazos V4 y V5. En el extremo distal del domino exterior se encuentra el bucle V3 que contacta con el V1/V2 mediante enlaces de hidrógeno. Este contacto entre ambos dominios es responsable de la formación de la lámina puente (Kwong et al., 1998).
Esta glicoproteína es estructuralmente constante aunque flexible lo que le permite adoptar conformaciones alternativas al unirse mediante contactos suficientes con sus ligandos, tales como la gp41 que mediará la fusión de la envoltura viral con la membrana celular, para conservar la integridad del complejo Env formado por las glicoproteínas gp120 y gp41 (Pancera et al., 2010).
El dominio exterior de la gp120 está altamente glicosilado, el dominio interior interacciona con la gp41, y la lámina puente conecta ambos dominios. La unión del receptor CD4 (presente en las células diana) con la gp120 se produce en una interfaz formada simultáneamente por estos tres dominios en una pequeña área de contacto, una cavidad, que está ocupada un anillo aromático del residuo fenilalanina en posición 43 en el extremo de CD4. Esta cavidad está muy conservada y es crucial para el ciclo de vital del virus (Grupping et al., 2012).
El plegamiento inducido por la unión del receptor CD4 proporciona mecanismos que reorganizan la gp120 en las conformaciones alternativas necesarias para la entrada viral (Pancera et al., 2010).
Los lazos variables V1-V5 de gp120 no siempre adoptan la misma conformación cuando se alejan de la conformación nativa de Env (Merk y Subramaniam, 2013). Se han observado múltiples conformaciones, sobre todo para el bucle V3. Por esta razón, se sugiere que la estructura puede variar dependiendo de las distintas interacciones de gp120, bien sea con anticuerpos o con receptores (Merk y Subramaniam, 2013).
Teniendo en cuenta los resultados de las investigaciones, se sugiere una arquitectura de la gp120 “a capas”, lo cual permite una amplia diversidad de conformaciones. La capa más interior es un elemento β-sandwich estructuralmente estable, la capa intermedia está formada por los bucles V1/V2 y finalmente, la última capa corresponde al dominio exterior glicosilado (Pancera et al., 2010).
Así, la interacción entre gp120 y gp41 permite una conformación meta-estable previa a la fusión de las membranas celular y viral, y conformaciones plegadas para unirse a los receptores (Pancera et al., 2010). El cambio de conformación de la gp120 al unirse a los receptores celulares es lo que controla los cambios conformacionales de la gp41 para mediar la fusión de membranas.
Los mecanismos del VIH que le permiten adoptar diversas conformaciones para mediar la entrada a las células, también le otorgan la posibilidad de la evasión del sistema inmune. Esta evasión se produce gracias a cambios conformacionales que ocultan sitios de anclaje, como el sitio de unión al receptor CD4, necesarios para proseguir con la infección. Por otra parte, la flexibilidad de la molécula confiere cierta resistencia a la neutralización debido a las interacciones con los bucles variables. También se incluye el escudo de glicanos como mecanismo de evasión inmune, pues enmascara la estructura total de la proteína impidiendo así el reconocimiento por la mayoría de anticuerpos neutralizantes (Pancera et al., 2010).
6. Estructura y función de la glicoproteína gp41
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En 1997 se obtuvieron los primeros resultados sobre la estructura de gp41. Esta glicoproteína transmembrana consta de unos 345 aminoácidos. Todavía no ha sido posible la obtención de la estructura detallada de la gp41. Sin embargo, sí se han desarrollado modelos simplificados de su estructura en los que esta glicoproteína presenta como un paquete de seis α-hélices antiparalelas (Merk y Subramaniam, 2013).
Se distinguen dos dominios con estructura de α-hélice, HR1 y HR2 (Ramírez, 2015). En el N-terminal se localiza un péptido, denominado “de fusión”, (residuos 512-527) (Cao et al., 1993) rico en glicina y altamente hidrofóbico (Chan et al., 1997) que resulta esencial para la fusión de la envoltura viral con la membrana celular. Se realizaron estudios de proteólisis de la gp41 obteniendo así los fragmentos peptídicos estables N51 (4-3 regiones hidrofóbicas repetidas adyacentes al péptido de fusión) y C43 (deriva de la región previa al segmento transmembrana) (Chan et al., 1997). Estos péptidos se asocian de manera antiparalela formando que después se agrupan en un complejo trimérico.
La desnaturalización de los complejos N51/C43 es irreversible, posiblemente como resultado de la agregación de péptidos desplegados a elevadas temperaturas. Por este motivo, se diseñaron péptidos de menor longitud, N36 y C34, y más estables con un 100% de contenido en α-hélice. Por el contrario, estos péptidos más pequeños forman un complejo trimérico de heterodímeros que sí es reversible a las transiciones de desnaturalización térmica (Chan et al., 1997).
El complejo trimétrico es un haz de seis hélices antiparalelas. Tres hélices C34 envuelven a las tres hélices N36, localizándose así las hélices C34 en la periferia y las N36 en el interior del complejo. Las dimensiones de este complejo casi cilíndrico son aproximadamente 35Å de diámetro y 55Å de altura (Chan et al., 1997).
Las hélices C34 interaccionan principalmente mediante residuos hidrofóbicos (Ile635, Trp631, y Trp628) con los surcos situados en hélices N36. Cada una de las cavidades está formada por los residuos de las hélices N36: Val570, Lys574 y Gln577 (pared izquierda), Leu565 y Leu566 (techo), Leu568, Trp571 y Gly572 (pared derecha), y Thr569, Ile573 y Leu576 (suelo), (Chan et al., 1997).
Por otra parte cabe destacar las mutaciones puntuales: Leu568→Ala, Trp571→Arg, y Asn656→Leu, pues son particularmente notables porque los virus que expresan las glicoproteínas mutantes son completamente defectuosos en la fusión de membranas (Cao et al. 1993).
Se han diseñado péptidos sintéticos de unos 40 residuos que inhiben la infección por VIH. Estos inhibidores son eficaces desde concentraciones nanomolares a micromolares. Estos péptidos parecen bloquear la fusión al interferir en la formación del trímero gp41 (Chan et al., 1997). Existe evidencia de que esta estructura obtenida de las investigaciones se corresponde con el núcleo de la gp41, puesto que el complejo N36/C34 se pliega en ausencia de gp120. Para su actividad fusogénica precisa de cambios conformacionales de la gp120, exponiendo así a la gp41 que libera el péptido de fusión para mediar la entrada del genoma viral a la célula. Igualmente, el receptor de gp120 (CD4) induce cambios en la gp41. Se cree que todos estos cambios conformacionales son esenciales para la actividad de fusión de membrana (Chan et al., 1997).
La región de gp41 (residuos 528 a 562) inmediatamente al lado del péptido de fusión es de gran importancia para la asociación con la gp120. Los cambios conformacionales en la gp120 pueden desencadenar cambios en dicha región de gp41 esenciales para la fusión de membranas. Además, los estudios de mutagénesis en la gp120 indican que algunos lugares estrechos de carácter hidrofóbico situados en las regiones C1, C3, C4 y C5 de gp120 contribuyen a la afinidad por la interacción entre gp120 y gp41 (Cao et al. 1993).
